好消息一：

C12-200有效遞送siRNA^[1]，通過組合篩選，可實(shí)現(xiàn)低劑量，高效率的基因沉默效果。

好消息二：

AVT的C12-200已上線，歡迎詢價(jià)采購。

在發(fā)現(xiàn)和開發(fā)能夠引導(dǎo)小干擾RNA(SiRNA)通過許多屏障保護(hù)目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)部的載體方面，人們做出了巨大的努力。雖然研究已經(jīng)顯示基因沉默在體內(nèi)的潛力，但要發(fā)揮RNA干擾療法的zui廣泛潛力，必須提高給藥效果。通過組合，合成和篩選不同類別的材料，已經(jīng)確定了一種能使siRNA引導(dǎo)的小鼠肝臟基因沉默的配方，其劑量低于0.01毫克/千克。這種制劑在一次注射后還能同時(shí)抑制五個(gè)肝基因的表達(dá)。這種制劑的潛力在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，在這種情況下，在低至0.03mg/kg的劑量下，觀察到臨床相關(guān)基因轉(zhuǎn)胸腺肽的高度敲除水平。據(jù)文章所示，這種制劑有助于基因沉默，其劑量比任何先前描述的siRNA肝傳遞系統(tǒng)所要求的低一個(gè)數(shù)量級(jí)。

Lipidoid-siRNA制備

Lipidoid-siRNA制劑的體內(nèi)篩選是由類脂，膽固醇，和PEG脂質(zhì)組成。在100、20和100 mg/mL的無水乙醇中分別溶解得到了類脂、膽固醇和DMG-mPEG 2000的原液。各組分按照比例組合，質(zhì)量比為52：20：28。在200 mM的醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)中加入有機(jī)相，攪拌形成空脂質(zhì)體。在50 mm的醋酸鈉溶液中加入10 mg/mL的siRNA，以總脂質(zhì)：siRNA為10：1的比例，將siRNA加入空脂質(zhì)體中，在37?℃下孵育30 min。然后用3,500 MWCO的透析盒(皮爾斯)對(duì)PBS進(jìn)行透析75 min。在緩沖液交換后，每種制劑的樣品被用于粒子的表征。采用改良的RiboGreen法(Invitrogen)定量siRNA的包封率，用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)量平均粒徑。

用Jeffs等人提出的方法制備了C12-200-siRNA。用90%乙醇(摩爾比50：10：38.5：1.5)對(duì)C12-200、DSPC、膽固醇和mPEG 2000-DMG進(jìn)行增溶。siRNA在10 mm檸檬酸鹽溶液中溶解（pH3.0，緩沖液濃度為0.4mg/mL）。用裝有雙相泵頭的蠕動(dòng)泵，在等效體積流量下，混合在“T"結(jié)中，對(duì)乙醇脂質(zhì)溶液和siRNA水溶液進(jìn)行了泵提。脂質(zhì)與siRNA的結(jié)合比例為7：1(wt:wt)。用PBS(155 mm NaCl，3mm Na2HPO4，1mm KH2PO4，pH7.5)對(duì)自發(fā)形成的C12-200-siRNA進(jìn)行透析，去除乙醇和交換緩沖液。

組合設(shè)計(jì)

圖1：通過組合，設(shè)計(jì)了陽離子脂質(zhì)化合物庫。

基于脂質(zhì)的載體介導(dǎo)的siRNA體外釋放。

以熒光素酶表達(dá)的Hela衍生細(xì)胞株為研究對(duì)象，以高通量的方式篩選脂質(zhì)類材料。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，穩(wěn)定表達(dá)酶。在本實(shí)驗(yàn)中，以質(zhì)量比2.5：1，5：1，10：1和15：1的脂質(zhì)：siRNA進(jìn)行絡(luò)合，并與細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育。熒光素酶的表達(dá)在不發(fā)生腎素還原的情況下被認(rèn)為是siRNA介導(dǎo)的沉默，而renilla的表達(dá)被作為脂質(zhì)相關(guān)毒性的內(nèi)部對(duì)照。細(xì)胞毒性試驗(yàn)也沒有任何不良反應(yīng)的證據(jù)。在這個(gè)篩選中，發(fā)現(xiàn)了許多有助于熒光素酶沉默的化合物，其中三個(gè)化合物的沉默率超過90%。為了便于展示，只顯示了5：1的質(zhì)量比的數(shù)據(jù)。有趣的是，從這些結(jié)果中出現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)-活動(dòng)關(guān)系。就尾部長(zhǎng)度而言，在15種性能好的結(jié)構(gòu)中，有7種結(jié)構(gòu)的尾長(zhǎng)為14碳。此外，尾巴長(zhǎng)度小于12-碳的化合物也不會(huì)引起大于30%的沉默。在頭部基團(tuán)設(shè)計(jì)中，amine 113存在于前兩種化合物和前15種化合物中的三種。雖然在C14尾和amine 113上的趨同是明顯的，但并不是所有含有這些結(jié)構(gòu)的化合物都表現(xiàn)出沉默活性。例如，在體外，C8-113和C14-116都不能促進(jìn)基因沉默，這表明通過優(yōu)化胺基和尾長(zhǎng)的組合來提高傳遞效率是必要的。

圖2：脂質(zhì)體庫的體外篩選

在表達(dá)熒光素酶的Hela細(xì)胞中，對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行篩選。（A）將抗熒光素酶的siRNA與可電離陽離子脂質(zhì)復(fù)合，與培養(yǎng)基中的細(xì)胞共同孵育。（B）小劑量siRNA沉默熒光素酶。

圖3：在小鼠體內(nèi)沉默FVII因子。

圖4：通過檢測(cè)FVII蛋白水平，觀察C12-200介導(dǎo)的基因沉默在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間超過40天。

圖5：五個(gè)位于肝臟的基因靶點(diǎn)。

據(jù)我們所知，這是關(guān)于siRNA介導(dǎo)的五個(gè)肝臟靶點(diǎn)在體內(nèi)同時(shí)沉默的最早報(bào)道?？紤]到C12-200介導(dǎo)的遞送的效力，我們假設(shè)更多的基因可以同時(shí)被合并的siRNA產(chǎn)物沉默。從治療的角度來看，這可以實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的治療方法，其中多個(gè)靶點(diǎn)的沉默可以獲得增強(qiáng)的治療效果。例如，這種策略可能特別適用于治療病毒感染，如丙型肝炎病毒（HCV），在這種病毒感染中，快速進(jìn)化的病毒基因組已被證明對(duì)單一序列的siRNA難以實(shí)現(xiàn)。事實(shí)上，這一想法以前已經(jīng)在體外證明，利用核糖核酸內(nèi)切酶制備的siRNA和編碼針對(duì)HCV基因組多個(gè)區(qū)域的短發(fā)夾RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行遞送。這種多靶點(diǎn)治療方法還可以采用不同的策略來治療多因素疾病，如代謝綜合征、癌癥或感染性疾病

圖6:C12-200-siRNA顆粒通過大細(xì)胞吞噬引起細(xì)胞攝取

（A） 用C12-200配制的熒光標(biāo)記的siRNA與HeLa細(xì)胞在各種內(nèi)吞途徑的標(biāo)記標(biāo)記物存在下孵育。含有siRNA的顆粒與標(biāo)記的葡聚糖共定位，葡聚糖是一種已知通過大細(xì)胞吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞的液相標(biāo)記物（白色箭頭）。（B） 肌動(dòng)蛋白纖維的熒光標(biāo)記揭示了在HeLa細(xì)胞暴露于C12-200-siRNA顆粒的15分鐘內(nèi)，膜褶皺（白色箭頭）和肌動(dòng)蛋白重排，這是大胞飲攝取的標(biāo)志性指標(biāo)。（C，D）細(xì)胞先前暴露于EIPA和Cytochalasin D，分別是大胞飲和肌動(dòng)蛋白聚合的抑制劑，以劑量依賴性的方式減少C12-200-siRNA顆粒的攝取。（s.d.，n=3，***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05

圖7:C12-200對(duì)非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的治療效果。

食蟹猴（每組n=3）通過頭靜脈接受PBS或0.03、0.1或0.3 mg/kg在C12-200中配制的siTTR，作為15分鐘的靜脈輸注（5 mL/kg）。在給藥后48小時(shí)從動(dòng)物身上采集肝活檢。在肝臟樣品中測(cè)定TTR mRNA水平相對(duì)于GAPDH mRNA水平。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表組平均值±s.d

本研究最終認(rèn)為：開發(fā)安全有效的siRNA遞送載體是基于RNAi的治療方法持續(xù)進(jìn)步的重要組成部分。隨著C12-200等高效材料的鑒定，可以實(shí)現(xiàn)更寬的治療指數(shù)、持久的基因沉默和多靶點(diǎn)治療疾病的方法。

Reference：

[1]. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing